Вы здесь

Иммуногенодиагностика в практике лечащего врача

_Title Иммуногенодиагностика в практике лечащего врача
_Author
_Keywords

С. В. Сучков, доктор медицинских наук, профессор, ММА, МОНИКИ


1. Введение

Важнейшими особенностями современной клинической медицины являются широкое использование высокоинформативных лабораторно-диагностических технологий и стремительное внедрение в практику здравоохранения новых лабораторных методов. Внедренные в клиническую практику в рациональных и обоснованных комбинациях, такие технологии значительно расширили, а в ряде случаев существенно изменили представления об этиологии и патогенезе многих известных заболеваний инфекционной, аутоиммунной и опухолевой природы. Более того, современная технологическая база предоставила врачу возможность оперативно вносить в лечебные схемы соответствующие редакции, что обеспечило более гибкий подход к разработке долгосрочных программ лечебно-реабилитационных мероприятий у больных с хронически-рецидивирующими, системными аутоиммунными и опухолевыми заболеваниями [28, 30].

Современная система доказательной медицины выдвигает для врача-клинициста несколько задач:



  1. постановка диагноза на основе полученных лабораторных или других диагностически значимых методов (скрининг);
  2. контроль за лечением (мониторинг);
  3. определение степени резистентности к схеме лечения;
  4. контроль излеченности пациента и формирование прогноза.

Эти задачи на всех этапах призваны решать современные наукоемкие технологии, к которым принадлежит арсенал методов иммуно- и генодиагностики.

2. Характеристики основных методов иммуно- и генодиагностики,  применяемых в практике лечащего врача

2. 1. РИФ


Метод РИФ основан на определении в составе анализируемого объекта радиоактивно меченных иммунных комплексов. Чаще всего применяется для идентификации инфекционных агентов, аутоантител, оценки иммунного статуса (субпопуляции лимфоцитов и других иммунокомпетентных клеток, маркеры активации, молекулы адгезии и др.) [2, 3].

2.2. ИФА

Метод ИФА-диагностики основан на инструментальной оценке взаимодействия комплексов иммунореагентов-антигенов и антител с использованием индикаторной ферментной метки. Этим методом, помимо традиционного использования в клинической биохимии для идентификации гормонов и ферментов, определяют антитела к различным инфекционным агентам, некоторым лекарственным препаратам, аллергенам, аутоантитела, общее содержание иммуноглобулина класса Е. Метод позволяет также определять и антигены, что особенно широко применяется при диагностике онкологических заболеваний при использовании ИФА-тестов на онкомаркеры. Большое значение для понимания тонких механизмов развития иммунной недостаточности и ассоциированных с ней заболеваний имеет определение с помощью ИФА уровня цитокинов и растворимых к ним рецепторов [2, 5].

2.3. Методы клинической генодиагностики

Большие перспективы открывают методы молекулярной диагностики. Наиболее широкое клиническое применение из них нашла ПЦР-детекция нуклеотидного материала  микроорганизмов путем многократного увеличения числа копий консервативных участков их генома. Среди основных нозологических категорий, входящих в сферу применения этих методов, - заболевания инфекционной природы, наследственные и опухолевые формы патологии и др. До недавних пор данные методы  ограничивались детекцией медленнорастущих и труднокультивируемых микроорганизмов, что было в значительной степени обусловлено отсутствием адекватной лабораторной инфраструктуры и рядом технологических ограничений [28, 32, 34, 38, 42, 51].

Благодаря достижениям последних лет в области биотехнологии, которые непосредственно касались используемых в специализированных лабораториях программ и форматов молекулярного тестирования (например, автоматическая экстракция нуклеиновых кислот, высокоскоростная полимеразная цепная реакция, детекция мишени), клиническая генодиагностика была преведена в разряд универсальных и многообещающих для изучения широкого круга этиопатогенов, включая вирусы и внутриклеточные микроорганизмы. В нозологическом отношении среди групп инфекционных заболеваний, подлежащих генодиагностике, следует особо выделить  вирусные гепатиты, туберкулез, урогенитальные инфекции, герпетические и цитомегаловирусные менингоэнцефалиты, токсоплазмоз [7, 9, 10, 11, 20, 35]. Сегодня с помощью методов клинической генодиагностики можно определять типы возбудителей инфекционных заболеваний и в последующем оценивать их конкретную патогенетическую роль при формировании статуса острой или хронической формы инфекционного заболевания.

3. Современные принципы формирования программ комбинированного применения методов иммуногенодиагностики в клинической практике

Чтобы правильно разработать алгоритм обследования больного и интерпретировать результаты лабораторных исследований, врач-клиницист должен иметь представление об основных принципах методик, их преимуществах и недостатках.

Главные характеристики любого лабораторного метода - чувствительность и специфичность. Очевидно, что в идеале оба эти показателя должны приближаться к 100%. Но в реальной жизни они могут быть значительно ниже и существенно колебаться. Так, по данным Центра по контролю за заболеваниями (CDC, Атланта, США, 2000), показатели чувствительности и специфичности методов лабораторной диагностики инфекций, передающихся половым путем (ИППП), на основании анализов ряда лабораторий мира варьируют в следующих диапазонах: ПЦР - 80-95%, ИФА - 45-75%, РИФ - 20-70% [1, 22, 43].

На что должен обращать внимание врач?

3.1. Выбор объекта исследования

От правильного выбора объекта исследования зависит последующая тактика ведения больного. Клетки крови служат резервуаром для многих вирусов и внутриклеточных микроорганизмов, но их концентрация здесь нередко бывает значительно меньше, чем в основном очаге, и может оказаться ниже предела чувствительности лабораторного метода. Так, хотя установлено, что хламидии персистируют в моноцитах, определение их в этих клетках ДНК этого микроорганизма не является приемлемым маркером острого респираторного хламидиоза. В то же время исследование бронхоальвеолярного лаважа оказывается весьма информативным [9, 22].

При нейроинфекциях в качестве объекта исследования целесообразно использовать спинномозговую жидкость. Следует отметить, что в крови возбудители выявляются в основном при генерализованных формах инфекции, при выраженной иммуносупрессии (например, цитомегаловирусная инфекция после трансплантации почки) [51, 52]. В ряде случаев  при урогенитальной патологии, особенно у женщин с вторичным бесплодием, хламидии могут персистировать в маточных трубах, в спайках, но при этом в соскобах их нижних отделов урогенитального тракта они не обнаруживаются. По некоторым данным, частота выявления Chl. trachomatis методом ПЦР у женщин составляет 22,5% при исследовании материала из цервикального канала, 29% - из влагалища и 14% - из уретры, поэтому для диагностики урогенитальных инфекций желательно брать материал из нескольких точек [53, 56].

Большое значение имеет то, как был получен от пациента образец. Неправильная техника забора биоматериала может привести к тому,  что инфицированные клетки не попадут в исследуемую пробу либо избыточное количество посторонних примесей (гноя, крови и др.) затруднит дальнейшее исследование. Неправильные транспортировка и хранение образца также негативно сказывается на результате анализа. Так, уже упоминалось, что гемолиз приводит к ингибированию ПЦР, а при повторных многократных замораживаниях и размораживаниях образцов снижается уровень специфических антител, что влияет на качество метода ИФА [1, 2].

3.2. Выбор метода и сроков исследования

Применительно к инфекционной патологии лабораторные исследования можно разделить на методы прямой детекции патогена (РИФ, ПЦР, иногда ИФА) и косвенные, при которых определяется уровень специфических аутоантител к возбудителю (ИФА, реже - РИФ).

Говоря о серологических исследованиях, следует помнить, что многие внутриклеточные микроорганизмы являются слабыми иммуногенами, то есть гуморальный ответ (продукция к микроорганизму аутоантител) на них развивается недостаточно. Поэтому при персистирующих, латентных инфекциях, вызванных атипичными микроорганизмами или вирусами, когда возбудитель не размножается и не выходит из клеток, антител может не быть [6].

Наличие большого количества серотипов возбудителей, что особенно характерно для микоплазм и уреаплазм, также затрудняет серодиагностику [46, 47, 49].  В частности, очень спорным является вопрос о роли атипичных микроорганизмов в развитии  хронически рецидивирующей патологии респираторного тракта [11, 13]. По данным ряда исследований, частота выявления антител к Chl. pneumoniae колеблется от 17 до 40%.

Сообщается также, что эти антитела были обнаружены у 88,4% лиц с острым бронхитом, у 73,3% лиц с бронхиальной астмой, причем иммуноглобулины класса A значительно чаще выявлялись при остром бронхите, чем при других патологиях. При обследовании детей с бронхиальной астмой ассоциация заболевания с Chl. pneumoniae была выявлена в 1/3 случаев, причем у 58% серопозитивных больных обнаружена реактивация персистирующего возбудителя, которая достоверно чаще происходила в период астматических приступов.

Многие специалисты считают, что инфекция микроорганизмом Chl. pneumoniae изменяет характер иммунного ответа у больных бронхиальной астмой, что ведет к прогрессированию аллергического воспаления в бронхах, а также способствует  персистенции инфекции и колонизации дыхательных путей другими возбудителями. Многоцентровые клинические исследования в этой области показали, что противохламидийная терапия у больных бронхиальной астмой, инфицированных Chl. pneumoniae, значительно улучшает течение заболевания и снижает зависимость от стероидов. В то же время не было обнаружено достоверной взаимосвязи инфекционного процесса и аллергического воспаления, что ставит под сомнение роль Chl. pneumoniae в развитии бронхиальной астмы [48, 49]. 

Как правило, серологическими методами целесообразно пользоваться:



  • при наличии распространенных инфекционно-воспалительных процессов;
  • при послеродовых осложнениях, когда массивная антигенная нагрузка обеспечивает выработку достаточного количества антител;
  • для диагностики внутриутробных инфекций (в режиме исследования парных сывороток матери и плода) [23, 24].

РИФ в большой степени подходит для диагностики острых инфекций; при бессимптомных или вялотекущих инфекциях метод недостаточно чувствителен. Кроме того, по мнению ряда авторов, его нельзя использовать для контроля эффективности лечения хламидиоза, так как с одной стороны, липополисахарид и белки наружной мембраны могут достаточно долго оставаться в организме хозяина, генерируя флюоресценцию даже после элиминации возбудителя, а с другой - под влиянием антибиотиков возбудитель может модифицироваться, переходить в персистентную форму и соответственно не обнаруживаться специфическими моноклональными антителами.

Молекулярно-генетические методы пригодны как для диагностики манифестированных форм инфекции, так и для латентных, субклинических форм, когда отмечается длительная персистенция возбудителя. Но следует помнить, что обнаружение генетического материала возбудителя служит лишь свидетельством инфицирования, а не инфекционного заболевания. Другими словами, эти методы не являются безусловным доказательством этиологической значимости выявленного возбудителя в патологическом процессе [16, 31, 58].

В известной степени решением проблемы определения этиологии заболевания может стать  модификация ПЦР в режиме реального времени (real-time PCR), которая соединила в себе достоинства традиционной ПЦР - высокую чувствительность и специфичность, с одной стороны, и количественного ИФА - с другой, что позволяет не только идентифицировать микроорганизм, но и определять количество возбудителя в пробе. Это особенно актуально для мониторинга течения и эффективности терапии таких социально значимых заболеваний как ВИЧ-инфекция туберкулез и вирусные гепатиты. Данный метод уже  используется в крупных научно-диагностических центрах и, вероятно, в ближайшие годы войдет в широкую практику отечественного здравоохранения [14, 33, 44, 59, 60].

Весьма перспективно применение молекулярно-генетических технологий для ранней диагностики онкологической патологии и заболеваний, предшествующих стадии онкогенеза. За последние десятилетия отмечается неуклонный рост этой патологии, а количество картированных и клонированых генов, вовлеченных в канцерогенез, увеличивается с каждым днем. Поэтому молекулярно-биологические исследования в онкологии являются самостоятельным направлением в геномике человека и на сегодняшний день составляют в большей степени фундаментальную проблему, разрешения которой требует клиническая практика [21, 29].

Молекулярная диагностика в онкологии сегодня - это обширное поле для научно-исследовательской и практической деятельности, имеет она принципиальное значение для клиники. Условно в этой сфере можно выделить следующие основные направления:



  • диагностика наследственных форм рака;
  • поиск и диагностика молекулярных маркеров неблагоприятного прогноза при онкологических заболеваниях;
  • поиск маркеров и диагностика микрометастазов;
  • диагностика полиморфных ДНК-маркеров, предрасполагающих к онкогенезу.

В настоящее время доказана связь определенных вариантов организации генов с диабетом, аутоиммунным тиреоидитом, ревматоидным артритом, рассеянным склерозом, злокачественными опухолями и некоторыми другими заболеваниями. Выявлено более 20 заболеваний, ассоциированных с генами, в том числе с локусами HLA. В ряде случаев по наличию маркерных изменений в этих генах удается определить пациентов, риск которых заболеть в 100 раз превышает среднестатистические значения. Сюда можно отнести мышечную дистрофию Дюшенна (МДД), которая является наиболее распространенным наследственным нервно-мышечным заболеванием человека. Его частота - около 1:5000 новорожденных мальчиков. Наследственные формы рака молочной железы составляют около 5% всех карцином молочной железы [10, 50, 59].

Поиск прогностически ценных молекулярных маркеров при раке молочной железы, предстательной железы, колоректальных опухолях, меланомах, нейробластоме - одно из наиболее разрабатываемых направлений исследований в сфере клинической генодиагностики соматических заболеваний. Так, методами ПЦР-анализа и блоттинга установлено, что экспрессия и гиперэкспрессия ряда генов  - неблагоприятные признаки развития заболевания [29]. 

Важным направлением является диагностика микрометастазов в крови, лимфатических узлах и костном мозге, что особенно актуально при высокоинвазивных опухолях, для контроля эффективности лечения и мониторинга в периоды ремиссий. Молекулярные методы позволяют определить 1-2 клетки среди 1-5 млн. лимфоцитов. Основным методическим подходом для такой диагностики считается полимеразная цепная реакция  на обратнотранскрибированной мРНК (RT-PCR), выделенной из анализируемого образца. Экспрессия опухолеспецифических генов, характерная для метастатической клетки, позволяет идентифицировать ее среди сотен тысяч неизмененных клеток. Поэтому одной из задач этого направления исследований является определение круга генов, экспрессирующихся в том или ином типе опухоли. Для ряда опухолей (меланома, метастазирующая нейробластома, микрометастазы рака молочной железы и др.) такие маркеры уже найдены [36].

ИФА также достаточно широко применяется для диагностики онкологической патологии, но из-за сложностей в интерпретации результатов его можно считать в этой сфере лишь вспомогательным диагностическим методом. Кроме того, нельзя забывать, что на результаты могут влиять некоторые лечебно-диагностические процедуры. Например, процедуру по определению уровня простатического антигена (PSA) можно выполнять не ранее чем через неделю после урологического обследования или массажа предстательной железы, так как эти манипуляции способствуют выбросу в кровь значительного количества онкомаркера [4].

Гораздо выше информативность ИФА при исследовании онкомаркеров в динамике; так, снижение уровня сывороточных онкомаркеров после хирургического лечения с последующим повышением может указывать на присутствие метастазов.