Акт исследований антитоксической активности и сорбционной емкости препарата «Рекицен-РД»

25 января 1995 года г. Киров

УТВЕРЖДАЮ

Начальник научно - исследовательского

института микробиологии Министерства

обороны Российской Федерации

доктор медицинских наук

академик МАИ Е.В. Пименов

30 января 1995г

В соответствии с «Программой структурной перестройки экономики и внешних связей Кировской области», подпрограммой «Биотехнология», проектом «Биокорма», подпроектом «Рекицен-РД» в период с 01. 09.94г. по 25.01.95г. на базе отдела токсинологии НИИ микробиологии МО РФ комиссия в составе: начальника отдела токсинологии, кандидата биологических наук Рудого Б.А. (председатель); старшего научного сотрудника, кандидата медицинских наук Юрченко А.В. (зам. председателя) и членов комиссии: научного сотрудника, кандидата медицинских наук Луба М.Ю.; младшего научного сотрудника Федотова А.К. и лаборанта-исследователя Повышевой Т.П. провела анализ антитоксической (токсиннейтрализующей) активности и сорбционной емкости препарата Рекицен-РД, полученного из ТОО «ЭкоБиоТехноЦентр» (г. Москва).

Испытаниям были подвергнуты три серии препарата Рекицен-РД, с условными обозначениями С-1, С-2, С-3.

Для определения антитоксической активности использовали специально приготовленные опаспортизованные препараты следующих токсинов:

ботулинического токсина типа А с удельной активностью 2х107ЛД50/мг белка, рабочее разведение 100ЛД50/мл; шигеллезного токсина удельной активностью 1,3х104 ЛД50/мл, рабочее разведение 1000ЛД50/мл;
термолабильного энтеротоксина кишечной палочки (по механизму действия аналогичный холерному токсину) с удельной активностью 1,8х103 ЕД50/мг белка, рабочее разведение 1000 ЕД50/мл.

Определение величин ЛД50 для ботулинического и шигеллезного токсинов проводили в опытах на белых мышах при внутрибрюшинном заражении с шагом разведения равным 2. Для термолабильного энтеротоксина кишечной палочки величину ЕД50 определяли на белых мышах в тесте отека задней конечности (шаг разведения равен 5). Расчет величин ЛД50 и ЕД50 соответствующих токсинов осуществляли по методу Кербера в модификации Ашмарина. Рабочие разведения препаратов токсинов готовили непосредственно перед проведением исследований. Для определения сорбционной емкости Рекицена-РД использовали краситель конго-рот (квалификации «Ч»), предварительно экспериментально подобрав его концентрацию.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РЕКИЦЕНА-РД

Навеску (1,0±0,001)г. Рекицена-РД вносили в пробирку с 10мл рабочего разведения соответствующего токсина и тщательно перемешивали. В контрольную пробу вместо Рекицена-РД добавляли (1,0±0,1)мл физиологического раствора. Пробы инкубировали в водяном ультратермостате в течение 1 часа при температуре (37,0±0,1)град.С. Затем производили центрифугирование проб на рефрижераторной центрифуге при 5000 об/мин. и температуре (10±1) град.С в течение 30 мин.

Надосадочную жидкость отбирали и определяли титр токсинов в опытной и контрольной пробах в экспериментах на белых мышах. Пробы, содержащие ботулинический и шигеллезный токсины, разводили с шагом равным 2 физиологическим раствором и вводили внутрибрюшинно белым мышам в объеме 0,5мл. За животными наблюдали в течение 7 суток, регистрируя их гибель.

При использовании термолабильного энтеротоксина кишечной палочки пробы разводили с шагом равным 5 и вводили животным в подошвенную поверхность одной задней конечности в объеме 0,05мл. В противоположную конечность вводили такое же количество физиологического раствора (контроль). Через 48 часов животных умерщвляли эфиром и производили ампутацию опытной и контрольной лапок по коленному суставу. Ампутированные конечности взвешивали на торсионных весах с точностью до 1мг. Разница веса опытной и контрольной лапок более 65мг свидетельствует о наличии в пробе термолабильного энтеротоксина.

Вся работа проводилась в асептических условиях. По результатам титрования на животных рассчитывали показатели относительной (по сравнению с контролем) токсичности опытной пробы по следующей формуле:

ОТ =Со/Ск х 100%, где

ОТ – относительная токсичность;

Со – концентрация (титр) токсина в опытной пробе;

Ск – концентрация (титр) токсина в контрольной пробе.

Результаты исследований представлены в табл.1.

Таким образом, в условиях проведения анализа 1г. Рекицена-РД нейтрализовал около 900 мышиных ЛД50 ботулинического токсина типа А, 9000 ЛД50 шигеллезного токсина и 8600 ЕД50 термолабильного токсина кишечной палочки.

Таблица 1. Результаты анализа токсинсодержащих проб после их обработки препаратом

Исследуемый препарат	Показатели антитоксической активности Рекицена-РД в отношении токсинов
	ботулинического		шигеллезного		термолабильного энтеротоксина
	ОТ, %М±м	Ки М±м	ОТ, % М±м	Ки М±м	ОТ, % М±м	Ки М±м
Рекицен-РД С-1	13,2±1,6	7,6±0,8	11,3±1,9	8,8±1,8	14,1±2,7	7,1±1
Рекицен-РД С-2	12,8±2,4	7,8±1,9	12,0±2,0	8,3±1,7	13,8±2,8	7,2±1
Рекицен-РД С-3	13,4±2,3	7,5±1,4	11,6±1,7	8,6±1,2	14,6±3,1	6,8±1
Контроль	98,6±8,9	1,01±0,11	108,4±10,7	0,9±0,2	92,7±9,6	1,1±0

Примечания:

1. Средние значения величин рассчитаны по результатам трех экспериментов с вероятностью в 95%.

2. Ки – коэффициент инактивации токсина (1/ОТ).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОРБЦИОННОЙ ЕМКОСТИ РЕКИЦЕНА – РД

Сорбционную емкость Рекицена-РД исследовали в отношении красителя конго-рот. Концентрацию красителя определяли фотометрическим способом на спектрофотометре СФ-26. Для этого предварительно строили калибровочный график зависимости экстинции от концентрации красителя в диапазоне от 10 мкг/мл до 136 мкг/мл.

Предварительно экспериментально подбирали рабочую концентрацию красителя, при которой получались наиболее информативные и воспроизводимые результаты. Она составила 90 мкг/мл.

Навеску (1,0±0,001)г Рекицена-РД смешивали с 10мл рабочего разведения красителя. Выдерживали в ультратермостате в течение 1 часа при температуре (37,0±0,1)град.С, периодически перемешивая. Затем пробы центрифугировали при 6000об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость переливали в другие пробирки и определяли в ней концентрацию красителя на спектрофотометре. По разнице концентрации красителя в контрольной и опытной пробах определяли коэффициент сорбции (Кс), который измеряли в единицах поглощения (ЕП). Одна ЕП соответствует одному мкг сорбированного красителя. Результаты анализа представлены в табл.2.

Таблица 2.Результаты определения сорбционной емкости Рекицена-РД.

Исходный препарат	Концентрация красителя, мкг/мл		Коэффициент сорбции,ЕП
	исходная	после взаимодействия с Рекиценом-РД
Рекицен-РД С-1	90±1	28±3	62±3
Рекицен-РД С-2	90±1	32±2	58±2
Рекицен-РД С-3	90±1	31±3	59±3

Примечания:

1. Средние значения концентрации красителя в опытных пробах и Кс определены с вероятностью в 95% по результатам четырех независимых экспериментов.

2. Кс рассчитан на 1,0г Рекицена-РД.

Таким образом, в результате проведенных исследований комиссия пришла к следующим выводам:

Рекицен-РД обладает выраженной неспецифической токсиннейтрализующей активностью в отношении ботулинического типа А, шигеллезного (дизентерийного) токсинов, а также термолабильного диарейного энтеротоксина кишечной палочки;
Антитоксические свойства Рекицена-РД, очевидно, обусловлены его способностью связывать (сорбировать) белковые токсины, что подтверждается результатами анализа сорбционной активности Рекицена-РД в отношении красителя конго-рот (Кс=59,6±4,95);
Полученные в ходе исследований результаты дают основание предположить, что Рекицен-РД будет обладать антитоксической активностью и в отношении других белковых токсинов биологического происхождения;
С учетом того, что термолабильный токсин кишечной палочки сходен по строению и свойствам с холерогеном, энтеротоксинами сальмонелл и некоторых других кишечных бактерий, препарат Рекицен-РД может оказаться эффективным средством профилактики и лечения пищевых отравлений различными белковыми токсинами. Для подтверждения этого предположения целесообразно провести дополнительные эксперименты на лабораторных животных, получающих корм, содержащий добавки токсинов и Рекицена-РД.

Председатель комиссии