Иммуногенодиагностика в практике лечащего врача (продолжение)

_Title Иммуногенодиагностика в практике лечащего врача (продолжение)
_Author
_Keywords

С. В. Сучков, доктор медицинских наук, профессор, ММА, МОНИКИ

3.3. Интерпретация результатов

Несмотря на достаточно высокую информативность рассмотренных методов лабораторной  диагностики,  при  интерпретации их результатов нередко возникают сложности, особенно если пациент неоднократно обследовался в разных лабораториях разными методами. По данным ряда источников, совпадение методов при лабораторной диагностике хламидиозов составила:

• ПЦР-анализ с культивированием клеток - 78%;
  
• ПЦР-анализ с РИФ - 67%;
  
• ПЦР-анализ с РИФ и культивированием клеток - 58% [17].

Чем можно объяснить такую гетерогенность результатов?  Наличие антител при отрицательных результатах РИФ или ПЦР может быть связано с ранее перенесенной инфекцией (наличие в организме “антител-свидетелей”) либо с локализацией возбудителя в органах, не доступных для взятия материала.

Отсутствие антител на фоне положительной РИФ или ПЦР может указывать:

• на начало инфекционного процесса, когда антительный ответ еще не развился;
  
• на латентную инфекцию;
  
• быть следствием иммуносупрессии или слабой иммуногенности возбудителя.

По данным эпидемиологических обследований, у 80-90% взрослого населения выявляются антитела к ВПГ или ЦМВ [19, 40]. Поэтому среди беременных основную группу риска составляют серонегативные лица, так как вероятность неонатальной передачи вируса при инфицировании во время беременности составляет 30-50%, а последствия очень серьезные (аномалии развития плода и летальность новорожденных до 70%) [52].

Такой же риск существует для женщин, серопозитивных по вирусу простого герпеса 1 (ВПГ-1), но заразившихся во время беременности ВПГ-2. Обычно считают, что признаком реактивации инфекции служит 4-кратное нарастание титров специфических антител в динамике, но на самом деле это не всегда так. В частности, повышение титров специфических антител в сыворотках, взятых в острую фазу и в период ремиссии, отличаются менее чем у 10% пациентов с рецидивирующей инфекцией ВПГ.

Следовательно, единичный анализ, даже при очень высоких титрах специфических IgG, нельзя считать убедительным критерием активного инфекционного процесса, поскольку их уровень может определяться только реактивностью организма на данный момент. То же самое можно сказать в отношении других серологических исследований на инфекции, передающиеся половым путем.

Диагноз, поставленный только на основании определения уровня специфических иммуноглобулинов, без подтверждения другими лабораторными методами, на наш взгляд, сомнителен. Вместе с тем при обнаружении антигена или генетического материала возбудителя у нелеченного больного всегда встает вопрос о показаниях к специфической терапии и, принимая решение, надо учитывать весь комплекс факторов (анамнез, клинику и т. д.). Для подтверждения излеченности необходимо не менее 3-4 серий исследований на протяжении, как минимум, 6 месяцев. При этом  нельзя забывать и о возможном риске реинфицирования, в том числе с участием иных, отличных от первоначального геновирусов и серотипов вируса  [6].

Применительно к вирусным гепатитам отрицательные результаты ПЦР при исследовании крови после терапии не всегда означают полную элиминацию возбудителя. Поскольку вирус способен персистировать в макрофагах, следует при соответствующих показаниях провести его детекцию в биоптатах печени. Проводя такого рода диагностику, нужно учитывать и тот факт, что при хроническом вирусном гепатите C, ассоциированным с синдромом криоглобулинемии, концентрация РНК возбудителя в криопреципитатах в десятки - тысячи раз выше, чем в плазме [25, 41].

Поскольку каждый из перечисленных методов лабораторной диагностики имеет те или иные ограничения,  наиболее рациональным является использование различных, но предварительно оговоренных между врачом-терапевтом и врачом-лаборантом комбинаций данных методов.  Так, РИФ, например, позволяет идентифицировать антигены возбудителя, ИФА дополняет РИФ, а также наряду с антигенами проводить детекцию антиинфекционных аутоантител, а молекулярно-диагностические тесты способны выявить и описать генетический материал возбудителя или группы возбудителей. Иными словами, первые две технологии составляют группу непрямых методов лабораторного анализа, тогда как ПЦР-технологии относятся к прямым методам детекции патогенного возбудителя.

Иногда динамика появления и смены антигенов отражает фазу инфекционного процесса и соответственно клиническую стадию заболевания. Так, при вирусном гепатите B одновременное обнаружение в сыворотке крови антигенов НВs, HBcor и Hbe является доказательным признаком реактивации инфекции, тогда как обнаружение в крови одиночного НВs-антигена свидетельствует об индукции интегративных процессов в жизненном цикле вируса, что имеет огромное значение для правильного выбора и/или смены программы лечебно-реабилитационных мероприятий.

Большинство хламидийных диагностикумов, основанных на методе РИФ, позволяют выявить элементарные тельца возбудителя, отражающие состояние и стадию жизненного цикла хламидий, что указывает на фазу активного инфекционного процесса и вооружает врача-клинициста информацией для принятия адекватного решения о структуре лечебной схемы [2, 3].

Однако  в большинстве случаев характер патологического процесса остается неясным, и врач не может однозначно дифференцировать латентную инфекцию, хроническую инфекцию (обострение или ремиссия), реинфекцию и т.д. В какой-то степени на данный вопрос может ответить исследование специфического иммунного ответа, в частности определение уровней специфических антител в различных биологических жидкостях методом ИФА.

Из классической иммунологии известно, что первичный иммунный ответ характеризуется повышением уровня иммуноглобулинов класса М (IgM), следовательно, этот показатель может служить маркером острого инфекционного процесса. Вторичный иммунный ответ характеризуется повышением IgG и IgA, поэтому обычно данные антитела указывают на обострение хронического процесса или реинфекцию. После перенесенной инфекции содержание антител памяти (IgG)  с течением времени снижается и может оставаться на уровне, характеризующем  реактивность конкретного организма. При латентной инфекции, когда возбудитель встраивается в ДНК клетки хозяина или персистирует в них, иммунный ответ не развивается, так как патоген не распознается иммунокомпететными клетками. Соответственно и уровень специфических антител будет низким [27].

Важную роль правильно подобранной комбинации современных лабораторных методов для своевременной диагностики патологического процесса, выявления его фазы и выбора схемы лечения можно проиллюстрировать на примере хронических миокардитов. Хорошо известно, что вирусная инфекция может при  определенных условиях (генетическая предрасположенность индивида и др.) запускать аутоиммунные процессы. 

Это связано с феноменом антигенной мимикрии, когда антигенные детерминанты возбудителя практически идентичны антигенным детерминантам клеток макроорганизма, и при развитии иммунного ответа в результате перекрестных реакций клетки собственных тканей подвергаются деструкции, а в дальнейшем продуцируются разнообразные аутоантитела к компонентам этих клеток. Данный феномен подтверждается на различных экспериментальных моделях вирус-индуцированных аутоиммунных заболеваний, таких, как рассеянный склероз, системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит, сахарный диабет 1-го типа и др.  [26].

Однако для  развития иммунного ответа требуется не только антиген-специфический сигнал, но и антиген-неспецифический. При отсутствии последнего антигенная стимуляция может привести к аллергии или апоптозу иммунокомпететных клеток. Спектр антиген-неспецифических сигналов очень широк: костимулирующие поверхностные маркеры, такие, как CD28 и его лиганд В7, CD40 и его лиганд CD154, многие цитокины (ИЛ-1, ФНО-a, ИЛ-4, ИЛ-12, ИЛ-13, a- и y-интерфероны, система комплемента) и др. Вся эта совокупность сигналов, возникающих при попадании вируса в макроорганизм, во многом определяет направление развития иммунного ответа и его конечный итог - элиминацию патогена и формирование протективного иммунитета либо индукцию и развитие аутоиммунных процессов [8, 26].

Недавно было установлено, что при экспериментальном вирусиндуци-рованном миокардите у мышей к 14-му дню после заражения вирус в крови не определяется. Тем не менее к 28-му дню у части животных развивался хронический миокардит, а в крови появлялись аутоантитела к  кардиальному миозину. При этом важную роль в развитии аутоиммунного миокардита играли факторы неспецифической резистентности (система комплемента и его рецепторы, NK-клетки) и ранние провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ФНО-a и интерфероны). С практической точки зрения это означает, что больным с хроническим миокардитом целесообразно проводить иммунологический мониторинг, включая определение уровней аутоантител к кардиомиозину и другим клинически значимым антигенам кардиомиоцитов.

Соответственно и тактика ведения этих больных должна быть разной: при наличии лабораторных признаков вторичного иммунодефицита (в частности, при снижении количества и функциональной активности NK-клеток) необходимо включать в комплексную терапию стимулирующие или корригирующие иммуномодуляторы, тогда как в случае детекции в крови аутоантител, иллюстрирующих синдром аутоиммунного поражения, наоборот, приоритетной становится иммуносупрессивная терапия, в том числе с включением кортикостероидов [26].

Бурное развитие иммунологии и молекулярной биологии привело к тому, что те методы, которые сегодня разработаны и апробированы в фундаментальных институтах, уже завтра будут применяться в практическом здравоохранении. Весьма перспективным направлением генодиагностики является секвенирование, в основе которого лежат модификации метода, а получаемая этим методом информация регистрируется в GENEBANK, National Center for Biotechnology Information and Ribosomal Database Project II [15].

На сегодняшний день большинство геномов клинически важных микроорганизмов остаются неизвестными. В то же время, несмотря на многообразие генетической информации, необходимо использовать ее осторожно и отбирать только достоверные и исчерпывающие базы данных. Наилучшим подходом является  вариант многофакторного анализа - использование данных секвенирования с хорошо составленной базой данных и фенотипическими и морфологическими характеристиками организма, например BioNumerics. Эта программа предназначена для хранения и анализа как данных молекулярных последовательностей, так и фенотипических характеристик организма и позволяет использовать многофакторный алгоритм идентификации организма [12, 45].

С помощью cеквенирования можно детектировать антибактериальную лекарственную устойчивость в клинических образцах, что очень важно для понимания генетической сущности устойчивости [19]. В большинстве тестов используется амплификация фрагмента того или иного гена устойчивости. Затем ампликон анализируется с помощью секвенирования [42]. Обычно такой анализ фокусируется на хорошо охарактеризованных генетических локусах, определяющих лекарственную устойчивость. В США для детекции генов антибиотикоустойчивости применяется только один коммерческий генетический тест для детекции штаммов Staphylocoсcus aureus, устойчивых к метициллину (ген mecA).

Молекулярные методы могут быть использованы также для детекции генов антибактериальной устойчивости  других микроорганизмов, таких, как   энтерококки (устойчивость к ванкомицину), Enterobacteriaceae (устойчивость к цефалоспоринам), Streptococcus pneumoniae (устойчивость к макролидам), Mycobacterium tuberculosis (устойчивость к рифампицину, изониазиду, стрептомицину, пиразинамиду и др.). Например, Mycobacterium tuberculosis - медленнорастущий микроорганизм, поэтому детекция генов устойчивости имеет особо важное значение для быстрой оценки клинической эффективности применяемой схемы лечения [40, 46]. Вирусы герпеса, устойчивые к ацикловиру и его производным, несут мутации или делеции в генам тимидинкиназы (ТК) и ДНК-полимеразы [46].

Таким образом, современные методы лабораторной диагностики являются важнейшей составляющей клинической процедуры диагностики и мониторинга и одним из ключевых диагностических инструментов для врача-клинициста в различных областях медицины. Еще большие возможности открывают методики, которые будут внедрены в клиническую практику в самое ближайшее время. Но, чтобы правильно пользоваться таким инструментом, необходимо иметь представление о преимуществах, недостатках и “подводных камнях” его.

Нередко в алгоритм обследования больного приходится включать несколько лабораторных тестов.  К сожалению,  применение тест-систем, не имеющих соответствующих сертификатов МЗ РФ, нарушение правил забора, хранения, транспортировки материала и самой методики, недостаточный профессионализм врачей-лаборантов вносят большую путаницу в интерпретацию результатов. Поэтому постановка диагноза всегда должна проводиться в привязке к клинико-анамнестическим данным и результатам других видов исследований. А в терапевтической тактике не следует переходить той грани, когда начинают лечить анализы, а не больного.