Влияние пептидов желчного пузыря при остром холецистите на иммунитет и «кислородный градиент»

_Title Влияние пептидов желчного пузыря при остром холецистите на иммунитет и «кислородный градиент»
_Author
_Keywords

Д.м.н. Сопуев А.А., Колигов Б.М. Национальный хирургический центр Кыргызской Республики, г. Бишкек

Несмотря на крупные достижения в хирургическом лечении больных острыми холециститами эта проблема по-прежнему является одной из ведущих в неотложной хирургии. Это объясняется ежегодным увеличением заболеваемости ОХ как в мире, так и в Кыргызской Республике. Это свидетельствуют о том, что наши знания о патогенезе ОХ не достаточны.

Влияние острого воспаления желчного пузыря на иммунитет изучалось и продолжает изучаться до последнего времени. Установлено, что при ОХ в организме больного развивается угнетение иммунитета, сопровождающееся уменьшением уровня иммуноглобулинов и нарушениями клеточного иммунитета.

Тщательно в настоящее времени изучены показатели «кислородного градиента» при ОХ. Установлено, что в организме при ОХ развивается гипоксемия.

Угнетение клеточного и гуморального иммунитета при ОХ объясняется влиянием продуктов воспаления и нейрореципрокными воздействиями воспаленного ЖП на организм. Вместе с тем в литературе имеются единичные исследования о влиянии самого воспаленного ЖП на иммунитет и «кислородный градиент». В то же время это затрудняет научное обоснование профилактики и лечение депрессии иммунитета и гипоксемии при хирургическом лечении ОХ.

Цель работы: - изучение влияния гуморальных факторов желчного пузыря больных хроническими калькулёзными, острыми катаральными, флегмонозными и гангренозными холециститами после лапароскопической холецистэктомии на иммунитет и «кислородный градиент» в эксперименте на кроликах.

Общая характеристика клинического материала. Клинико-лабораторные исследования выполнены у 130 больных ОХ, поступивших в НХЦ МЗ КР за период 1999-2002 г.

В основной клинической группе было 130 больных ОХ: 61 больной хроническими калькулезными холециститами (ХКХ), 12 больных острыми катаральными холециститами (ОКХ), 45 больных острыми флегмонозными холециститами (ОФХ) и 12 больных острыми гангренозными холециститами (ОГХ.

Из всех 130 прооперированных больных 114 составили женщины и 16 мужчины. ОКХ у 11 женщин и 1 мужчины, ОФХ у 36 женщин и 9 мужчин, ОГХ у 4 мужчин и 8 женщин и ХКХ у 59 женщин и 2 мужчин. Средний возраст больных составил 48,6±2,3 лет.

Все больные ОХ обследовались в момент поступления в НХЦ МЗ КР, на 1-е, 3-и, 5-е сутки и перед выпиской после ЛХЭ. Удаленные воспаленные ЖП больных холециститами по формам ОХ накапливались и хранились в морозильнике при t-20° С. В дальнейшем из этих ЖП по авторской технологии В.Х. Хавинсона, В.Г. Морозова (1980) методом уксуснокислой экстракции выделено 9 пептидных фракций.

Методы и сроки клинико-лабораторных и экспериментальных исследований. На микроаструпе «Compact-2» полуавтоматическом микропроцессорном анализаторе определяли показатели кислотно-шелочного равновесия (КЩР): активность ионов водорода (рН), парциальное давление двуокиси углерода (рСО2), парциальное давление кислорода (рО2), избыток оснований (ВЕ), избыток оснований во внеклеточной жидкости (BЕecf), буферная емкость (ВВ), бикарбонат (-НСО3).

Также изучалось содержание Т- и В- лимфоцитов, Т-супрессоров, суммарный цитотоксический коэффициент, фагоцитарный показатель, среднее количество частиц поглощенного латекса на одну клетку исходя из 100 клеток и интегральный фагоцитарный индекс. Гуморальный иммунитет оценивали по количественному содержанию IgА, IgM, IgY. Изучены 23 показателя сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза. Для контроля все вышеуказанные показатели исследованы у 10 практически здоровых людей. В работе также использовались общепринятые методики определения уровня гемоглобина (Нb), числа эритроцитов, цветного показателя (ЦП), гематокрита (Ht), числа лейкоцитов (L), лейкоформулы и СОЭ.

Характеристика экспериментального материала. Эксперименты проведены в летне-осенний период 2000г на 70 беспородных кроликах обоего пола, массой от 2 до 3 кг. Все животные до экспериментов содержались в виварии не менее 2-х недель, где они находились на обычном рационе, утвержденном ГОСТом для кормления животных.

Обследование иммунитета и «кислородного градиента» проводили до опытов (фон), на 15-й день внутримышечного введения пептидных фракций, а также на 10-й, 20-й и 30-й дни (соответственно 25-й, 35-й, 45-й дни опыта) после окончания 15-ти дневного внутримышечного введения. Пептидные фракции в наших опытах животным вводились внутримышечно в дозе 1 мг/кг массы тела. Перед введением пептидные фракции разводились в стерильном физиологическом растворе. Препараты вводились 1 раз в сутки в течение 15 дней. В качестве контроля (препарата сравнения) 7 животным в таком же объеме вводился стерильный 0,9% раствор хлорида натрия в те же сроки.

Работа с животными: До начала проведения экспериментов у животных тщательно выстригали шерсть в паховой области левого бедра. В течение 2-х недель до начала опытов каждый день один раз в сутки, каждое животное помещали на стол, и после обработки 1% спиртовым раствором йода производили одноразовым шприцом с иглой укол. Такая 2-х недельная тренировка животных позволила нам выработать «динамический стереотип» у них поведения и исключить влияние болевого постинъекционного стресса на изучаемые показатели.

Получение крови и плазмы: Кровь через силиконовый катетер из левого желудочка сердца, a. и v. pulmonalis забирали в силиконированную посуду с цитратом натрия (3,8%) в соотношении 9:1 и тот час же центрифугировали в течение 10 мин. при 1500 об/мин. Полученную плазму сразу отсасывали в силиконированную посуду и применяли в эксперименте. Кроме того, кровь помещали в кювету электрокоагулографа Н–334 (333) и записывали показатели электрокоагулограммы.

Экспериментальные кролики были разбиты на следующие группы:

1. 7 животных, у которых был обследован общий фон, характеризующий состояние клеточного, гуморального иммунитета и «кислородного градиента». Этим же животным в дальнейшем вводился физиологический раствор (группа сравнения).

2. 7 кроликов, у которых было исследовано состояние иммунитета и «кислородного градиента». Однако им в дальнейшем внутримышечно вводилась пептидная фракция ХКХG1 в течение 15-ти дней.

3. 7 кроликов, которым после фонового обследования 15 дней внутримышечно вводилась фракция ХКХG2.

4. 7 кроликов, подвергались, фоновому обследованию и им внутримышечно вводилась фракция ХКХG3.

5. 7 кроликам после фонового обследования внутримышечно вводили пептидную фракцию ХКХG4.

6. 7 кроликов также исследовали, до начала опытов и им внутримышечно вводился, пептид ОКХG.

7. 7 кроликов после фонового обследования в течение 15 дней получали внутримышечно инъекции пептидной фракции ОФХG1.

8. После фонового обследования 7 кроликов в течение 15 дней внутримышечно получали пептидную фракцию ОФХG2.

9. После фонового обследования 7 кроликов внутримышечно получали пептидную фракцию ОФХG3.

10. После фонового обследования 7 кроликам внутримышечно в течение 15-ти дней вводили пептид ОГХG.

Полученный материал обработан по Стьюденту методами вариационной статистики для связанных и не связанных между собой наблюдений и вычислен показатель достоверности различий (Р).

Результаты собственных исследований. Из воспаленных удаленных ЖП больных ХКХ после ЛХЭ выделяются 4, из ОКХ- 1, из ОФХ – 3 и ОГХ –1 пептидная фракция. Все выделенные пептидные фракции обладают способностью влиять на показатели «кислородного градиента» и иммунитета. У больных ХКХ с 44,3± 1,9 мм рт.ст. увеличено до 46,2± 1,2 мм рт.ст. (P
У больных ХКХ до операции выявлялось снижение клеточного и гуморального иммунитета: снижалась интенсивность восстановления нитросинего тетразолия, СЦК, уменьшалось число нейтрофилов способных осуществлять фагоцитоз, снижался уровень IgA, IgM. Отметим также, что у больных до операции было с 51,2± 2,9% снижено до 48,2± 1,3% содержание Т-лимфоцитов и увеличен с 108,8± 5,8 усл.ед. до 116,7± 5,6 усл. ед. (P

В течении 1-х суток после ЛХЭ количество Т-лимфоцитов с 48,2± 1,3% возрастало до 53,1± 2,3% (P

У опытных кроликов все 4 пептидные фракции ХКХ вызывали лейкоцитопению (P
Таким образом, при ХКХ в организме больных развивается гипоксемия, гиперкапния и накопление щелочных соединения. Из удаленных воспаленных ЖП больных ХКХ выделяются 4 пептидные фракции, которые после 15-ти дневного внутримышечного введения экспериментальным животным вызывают угнетение клеточного и гуморального иммунитета, гипоксемию и гиперкапнию аналогичную у больных ХКХ.

Из удаленных воспаленных ЖП при ОКХ выделяется 1 пептидная фракция. У больных ОКХ в крови с 44,3± 1,9 мм рт.ст. до 46,0± 1,1 мм рт.ст. (P

Также до операции и в течение 1-х суток после неё у больных ОКХ с 1,1± 0,1 был снижен до 0,7± 0,2 (P

Одновременно в крови опытных животных после введения этих фракций было снижено количество эритроцитов (P
Таким образом, из ЖП ОКХ выделяется 1 пептидная фракция. В организме больных ОКХ развивается депрессия клеточного, гуморального иммунитета, гипоксемия и гиперкапния. После 15-ти дневного внутримышечного введения выделенной из ЖП больных ОКХ пептидной фракции в организме животных, также как и у больных ОКХ, формируются депрессия клеточного, гуморального иммунитета, гипоксемия и гиперкапния.

Из ЖП при ОФХ выделены 3 пептидные фракции. У больных ОФХ в крови увеличено содержание в крови соединений обладающих щелочными свойствами, имеется гипоксемия и гиперкапния. Как правило, при ОФХ регистрируется выраженная гипохромная анемия, снижены показатели клеточного и гуморального иммунитета. У таких больных до операции с 51,2± 2,9 уменьшается до 45,1± 1,2 (P

Уровень IgM при ОФХ был резко снижен как до операции (P

Однако содержание В-лимфоцитов с 30,7± 1,2% возрастало до 38,6± 2,2% (P
Таким образом, в организме больных ОФХ регистрируется гипоксемия, гиперкапния и накопление уровня щелочных соединений. Из ЖП при ОФХ выделяется 3 пептидные фракции, которые после 15-ти дневного внутримышечного введения в организме кроликов формируют сдвиги показателей «кислородного градиента», клеточного и гуморального иммунитета аналогичные изменениям у больных при ОФХ.

У больных ОГХ выявляется при поступлении снижение с 37,9± 1,8 мм рт.ст. до 27,7± 2,1 мм рт.ст. рО2 (P
Влияние 15-ти дневного внутримышечного введения всех 9 выделенных пептидных фракций прослеживалось в крови взятой из сердца, а. и v. pulmonalis. Если учесть результаты наших предыдущих исследований и наши данные то, очевидно, что пептидные фракции циркулируют в организме больных ОХ и экспериментальных кроликов после 15-ти дневного введения. Согласно современным литературным данным на мембране эритроцитов имеются специфические рецепторы, к которым могут соединяться регуляторные пептиды. Мы в своем исследовании в качестве мессенджер-системы выбрали гемостаз и изучили влияние in vitro выделенных пептидных соединений на показатели свертывания крови. Оказалось, что при комбинированном ведении нескольких пептидных фракций выявляется потенцирующий эффект их влияния на показатели гемостаза.

Оказалось, что в присутствии in vitro все выделенные 9 пептидные фракции способны нарушать процессы присоединения и отдачи кислорода в эритроцитах. Выделенные пептидные фракции циркулируют в крови на мембране эритроцитов. 3-х кратное отмывание с физиологическим раствором эритроцитов способно удалять эти пептидные фракции в промывочные воды. Мы полагаем, что локализация гуморальных факторов воспаленного ЖП на мембране эритроцитов обусловливают гипоксемию и гиперкапнию в организме больных ОХ, сохраняющиеся даже на 3-и сутки после ЛХЭ. Эти выявленные нами факты свидетельствуют о неэффективности нормобарооксигенотерапии у больных ОХ до операции и в послеоперационном периоде.

Результаты нашей работы позволяют предложить важные для клиники практические рекомендации. Они заключаются в том, что для эффективной коррекции иммунитета и показателей «кислородного градиента» у больных ОХ при осложненном послеоперационном периоде, мы предлагаем эритроциты больного 3-х кратно отмывать физиологическим раствором с последующей аутореинфузией их.

Выводы:

1. У больных хроническими калькулезными, острыми катаральными, флегмонозными и гангренозными холециститами до лапароскопической холецистэктомии выявляется депрессия клеточного и гуморального иммунитета, гипоксемия, гиперкапния и накопление в крови основных соединений.

2. Гуморальные факторы, выделенные из желчных пузырей у больных острым холециститом, после 15-ти дневного внутимышечного введения в организме животных, также как и у больных, формируют депрессию клеточного, гуморального иммунитета, гипоксемию, гиперкапнию и накопление основных соединений в крови.

3. Выделенные гуморальные факторы циркулируют в крови больных острыми холециститами и экспериментальных животных после 15-ти дневного внутримышечного введения.

4. Эти гуморальные факторы воспаленных желчных пузырей в организме больных острыми холециститами и экспериментальных животных локализуются в структуре «белковой рубашки» эритроцитов.

5. Локализация этих гуморальных факторов в структуре «белковой рубашки» эритроцитов нарушает процессы присоединения и отдачи кислорода, углекислоты в организме больных острыми холециститами и экспериментальных животных, что проявляется гипоксемией, гиперкапнией и накоплением основных соединений в крови.

Список терминологических сокращений

АКТ - аутокоагуляционный тест;
Ат III - антитромбин III;
ВВ - буферные основания;
ВЕ – избыток оснований;
ВЕecf – избыток оснований во внеклеточной жидкости;
ЖП – желчный пузырь;
ИФИ – интегральный фагоцитарный индекс;
КЩР – кислотно-щелочное равновесие;
ЛХЭ - лапароскопическая холецистэктомия;
НСТ – нитросиний тетразолий;
-НСО3 – бикарбонат;
ОКХG - пептидная фракция, выделенная из острых катаральных желчных пузырей;
ОФХG1,G2, G3 - первая, вторая и третья полипептидная фракция, выделенная из острых флегмонозных желчных пузырей;
ОГХG - пептидная фракция, выделенная из острых гангренозных желчных пузырей;
ПДФ - продукты деградации фибрина;
П/я – палочкоядерные лейкоциты;
рН – активность ионов водорода;
СЦК – суммарный цитотоксический коэффициент;
С/я – сегментоядерные лейкоциты;
ТПГ - толерантность плазмы к гепарину;
ФА – фибринолитическая активность;
ФП – фагоцитарный показатель;
ХКХG1, G2, G3, G4 - первая пептидная фракция, выделенная из хронических калькулезных желчных пузырей;
ЦП – цветной показатель;
IgA, IgM, IgY – иммуноглобулины.

Источник: